產品介紹
EasyFusion Assembly Master Mix 是一種快速、簡單且高效的定向同源重組克隆試劑盒，可將目的片段一個或多個 （PCR 產物）定向克隆到任意載體的任意位置。該技術不依賴于 T4 連接酶、不受載體和目的片段的酶切位點限制， 僅需 15-30 分鐘實現高效無縫連接。
操作步驟
1.線性化載體準備
可以通過以下兩種方法獲得線性化載體，最終載體的濃度需>10 ng/μl。(高濃度的載體有利于提高效率)。
（1）選擇合適的酶切位點線性化載體。（單酶切或雙酶切均可， 5′端突出、3′端突出或平末端均適用）
（2）以載體為模板，設計引物，通過 PCR 的方式擴增出需要的線性化載體
2.擴增插入片段引物設計
通常通過 PCR 獲得目的片段，引物設計要保證目的片段兩端有至少 15bp-20bp 序列與線性化載體的兩端一致的 同源序列。PCR 每條引物長度至少在 35-40bp 之間，包括 5′ 端和 3′端與線性載體同源的 15bp-20bp（不包括酶 切位點）以及目的片段特異性序列 20-25bp。
（1）單個片段的引物設計：
引物包含目的基因特異性序列和重疊序列 插入片段正向擴增引物設計方式為： 5′-上游載體末端 15-20bp 同源序列+目的基因特異性正向擴增引物序列(20-25bp)-3′ 插入片段反向擴增引物設計方式為： 5′-下游載體末端 15-20bp 同源序列+目的基因特異性正向擴增引物序列(20-25bp)-3′ 設計引物時，可以參考以下實例（以 pUC19 線性化載體為例）：
3.PCR 擴增插入片段
推薦使用高保真聚合酶進行 PCR 擴增插入片段，以減少擴增突變的產生，選擇聚合酶時無需考慮末端有無 A 加尾 發生（重組過程中將會被去除，在最終載體中不會出現）。PCR 擴增結束后，對目的 PCR 產物進行純化：若是擴增模 板與克隆載體抗性不同，且 PCR 產物條帶電泳單一，產物可以無需純化直接用于重組反應，或者對 PCR 產物進行脫鹽 等簡單純化；否則，需要進行瓊脂糖凝膠電泳回收特異性的目的 PCR 片段。 4.重組反應進行 取出 EasyFusion Assembly Master mix, 置于冰浴中，配制下圖應體系（如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心沉降）
注意：10 ul 反應體系中，載體和各插入片段建議量在 20-50ng 之間，載體與各插入片段的最佳摩爾比為 1:2-1:3
輕輕混勻反應體系，50℃反應 15-30 分鐘（對于多片段重組或大片段重組，建議反應時間 30 分鐘，可延長反應時 間至 1 小時）；待反應結束后，將離心管置于冰上冷卻數秒，之后將重組產物保存于-20℃或用于轉化。
5. 反應產物轉化、涂板及克隆鑒定 建議所使用的感受態細胞效率要達到> 5X 107 cfu/ug。轉化步驟按照不同菌種的要求進行或者按標準轉化操作 進行即可。菌落長出之后，建議采用菌落 PCR 進行陽性克隆鑒定，或者對樣品進行測序確保正確。
保存條件及組成成分
-20℃保存及冰袋運輸 組成成分：2X EasyFusion Assembly Master Mix , 125ul; Linearized pUC19 Vector (10ng/ul),5ul;Control Insert（0.5kb, 20ng/ul),5ul
注意事項
1. 線性化載體或目的片段的純化的品質及濃度等較差會顯著降低克隆陽性率及克隆數。
2. 重組質粒大小的增加（>12kb），克隆效率會顯著降低，選擇穩定性更好的感受態及轉化效率更高效的感受態細胞。
3. 菌落較少時，建議適當增加重組反應產物的體積量，或者提高轉化產物量等。
4. 隨著重組片段數目的增加，克隆效率降低，建議增加引物重疊序列長度或適當延長反應時間。
