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  1. 您好,歡迎來到新賽美
    細胞生物學系列產品

    Cell Counting Kit-8

    CCK-8試劑盒

    貨號:
    C6005
    規格:
    500T
    目錄價:
    ¥499.00
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    產品介紹

    Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒,是MTT,XTT等的替代方法,一種基于WST-8(水溶性四唑鹽,化學名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。CCK-8溶液可以直接加入到細胞樣品中,不需要預配各種成分。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。對于同樣的細胞,顏色的深淺(生成的Formazan量)和細胞數目呈線性關系??捎糜谒幬锖Y選、細胞增殖和毒性測定、腫瘤藥敏等試驗。

    操作步驟

    . 制作標準曲線(測定細胞具體數量)

    1.先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量,然后接種細胞;

    2.按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,一般要做4-7個細胞濃度梯度,每組3-6個復孔;

    3.接種后培養2-4小時使細胞貼壁,然后加入CCK-8試劑(按每100 μL培養基加10μL CCK-8)培養一定時間后測定OD值,制作出一條以細胞數量為橫坐標,OD值為縱坐標的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量。(使用此標準曲線的前提條件是試驗條件完全一致)

     

    . 細胞活性檢測

    1.96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔),將培養板放在培養箱中預培養一段時間;

    2.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產生氣泡,它們會影響OD值的讀數);

    3.將培養板置于培養箱內孵育1-4小時;

    4.用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

     

    .細胞增殖-毒性檢測

    1.在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔),將培養板放在培養箱中預培養24小時;

    2.向培養板加入不同濃度的待測藥物;

    3.將培養板在培養箱孵育一段適當的時間;

    4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產生氣泡);

    5.將培養板置于培養箱內孵育1-4小時;

    6.用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。 

    注意:如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養基(除去培養基,并用培養基洗滌細胞兩次, 然后加入新的培養基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

     

    .活力計算

    細胞存活率*%=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

    抑制率*%=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

    As:實驗孔吸光度(含細胞、培養基、CCK-8 溶液和藥物溶液);

    Ac: 對照孔吸光度 (含細胞、培養基、CCK-8 溶液,不含藥物) ;

    Ab: 空白孔吸光度 (含培養基、CCK-8 溶液,不含細胞、藥物) 。


    保存條件

    4℃避光保存,有效期12個月;-20℃避光保存,有效期24個月

     

    實驗應用

    1. 細胞增殖測定:CCK-8是水溶性的,在培養基中穩定且無毒。

    2. 細胞活性分析,包括細胞毒性:代謝活性以及染料的形成與細胞的活性和損傷成比例。

    3. 細胞因子分析:測定細胞因子誘導的增殖,必要時,可在試驗結束時回收和擴增細胞

     

    注意事項

    1.CCK-8的培養時間一般為1-4小時,但在培養30分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度,根據細胞種類而定,需要摸索條件,CCK-8的最佳反應時間以具體顯色的最佳時間為準。

    2.使用96孔板進行檢測時,如果細胞培養時間較長,一定要注意蒸發問 題。一方面,由于96孔板周圍一圈最容易蒸發,可以采取棄用周圍一圈的辦法,改加相同量的PBS,水或培養液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培養箱內水源的地方,以緩解蒸發。

    3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應,所以還原劑 (例如一些抗氧化劑)會干擾檢測,如果待檢測體系中存在較多的還原劑,需設法去除。用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡,否則會干擾測定。

    4.加入藥物中如含有金屬,對 CCK-8 顯色有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%,15%,90% 的顯色反應,使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話,將會100% 抑制。

    5.培養基中的酚紅不會影響實驗結果,酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

    6.本產品可以檢測革蘭氏陰性細菌,但不能檢測革蘭氏陽性細菌和酵母細胞。向100μL培養液中加入10μL CCK-8溶液,并培養1-4小時或過夜。

    7.CCK-8試劑對細胞的毒性非常低。它和活細胞內的脫氫酶持續反應使溶液顏色不斷加深,OD值不斷增加(注: 活細胞內的脫氫酶是持續產生的)。

    8.要測定細胞的具體數量,建議同時做標準曲線。

    9.建議采用多通道移液器,以減小平行孔間的差異。

    10.以下方法可以終止CCK-8反應(96 孔板):(a).在顯色反應后,將培養板放置4°C冰箱內。(b).每孔加10μL 0.1M HCl溶液。(c).每孔加10μL 1% (w/v) 的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應停止后,應在24小時內測定。

    11. 本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品。

    12. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。


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